癌細胞通過操縱正常的生物學過程促使自身不斷增殖。神經(jīng)系統(tǒng)在癌癥調(diào)節(jié)中的作用越來越受到重視。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF（brain-derived neurotrophic factor）是大腦中神經(jīng)元突觸可塑性的關(guān)鍵介質(zhì)，它對神經(jīng)元的形態(tài)和生理功能發(fā)揮至關(guān)重要，可促進神經(jīng)元生長以及大腦神經(jīng)細胞突觸的形成和穩(wěn)定。

近期來自斯坦福大學神經(jīng)學科的研究者們在《Nature》上發(fā)表了題為“Glioma synapses recruit mechanisms of adaptive plasticity”的文章，這一突破性的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤通過BDNF使用神經(jīng)元活動，這一舉動與健康腦細胞相同：BDNF由神經(jīng)元傳至腫瘤細胞，激發(fā)細胞內(nèi)部連鎖反應，助力腫瘤形成更加復雜和強大的突觸網(wǎng)絡。

由于小兒膠質(zhì)瘤惡性細胞中BDNF受體TrkB呈高表達，但卻不表達BDNF，說明其中的BDNF來自于外部微環(huán)境。因此，研究者通過缺乏BDNF活性誘導表達的基因工程小鼠模型（Bdnf-TMKI）測試了神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)的BDNF分泌到腫瘤微環(huán)境中的作用。研究者在Bdnf-TMKI小鼠的深層皮質(zhì)投射神經(jīng)元中表達興奮性藍光門控視蛋白通道rhodopsin-2（圖1a），以實現(xiàn)皮質(zhì)投射（谷氨酸能）神經(jīng)元活動的光遺傳刺激。將患者來源的小兒膠質(zhì)瘤（DIPG）細胞異種移植到額葉皮層和皮層下白質(zhì)中，在移植5周后，用既定的方案（每天10分鐘，20Hz藍光刺激，30秒開/90秒關(guān)周期）刺激皮質(zhì)投射神經(jīng)元活動，持續(xù)1周。正如預期的，作者觀察到BDNF野生型小鼠在受刺激后膠質(zhì)瘤增殖增加。在缺乏BDNF活性調(diào)節(jié)的表達和分泌的Bdnf-TMKI小鼠中，皮質(zhì)投射神經(jīng)元活性調(diào)節(jié)對膠質(zhì)瘤增殖的影響明顯減弱（圖1b-d）。

鑒于以上結(jié)果，研究者接下來探討了神經(jīng)活性調(diào)節(jié)的BDNF對BDNF野生型和攜帶DIPG異種移植物Bdnf-TMKI小鼠的存活率影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元活動調(diào)節(jié)的BDNF表達和分泌的喪失導致腦干中攜帶患者來源DIPG異種移植物的Bdnf-TMKI小鼠生存優(yōu)勢明顯增加（圖1e），這與活動調(diào)節(jié)的BDNF信號在腦微環(huán)境中強烈影響膠質(zhì)瘤進展的假設(shè)一致。

研究表明，BDNF通過TrkB（由NTRK2編碼）受體作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，并且BDNF是兒童神經(jīng)膠質(zhì)瘤對其作出反應的關(guān)鍵神經(jīng)營養(yǎng)因子。因此，作者測試了遺傳或藥理學TrkB阻斷對小兒膠質(zhì)瘤生長的影響。將小鼠與患者來源的細胞原位異種移植。與移植了NTRK2野生型細胞的對照組相比，移植了腦干NTRK2-KO DIPG或額葉皮層NTRK2-KO兒科皮質(zhì)膠質(zhì)母細胞瘤的小鼠的總體存活率顯著增加（圖1f）。使用抑制劑治療侵襲性患者源性小兒膠質(zhì)瘤（DIPG）原位異種移植模型可提高總生存率（圖1g）。說明抑制劑對DIPG的作用機制是通過TrkB介導的。

后期作者通過將神經(jīng)元與NTRK2野生型或NTRK2-KO膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)來研究BDNF-TrkB信號傳導在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤相互作用中的相對貢獻。結(jié)果表明，在缺乏神經(jīng)元的情況下，TrkB損失并不會降低小兒膠質(zhì)瘤細胞的增殖（圖1i）。與神經(jīng)元共培養(yǎng)相比，BDNF配體單獨作用下TrkB損失引起的膠質(zhì)瘤增殖變化的程度（圖1h，i）。表明BDNF在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤相互作用中可能具有更復雜的作用，而不僅僅是作為一種活性調(diào)節(jié)的生長因子。

在兒童和成人膠質(zhì)瘤中，谷氨酸能神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸是由鈣滲透性AMPARs介導的，并能有效調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的進展。在健康的大腦中，BDNF-TrkB信號通過多個機制調(diào)節(jié)谷氨酸能突觸傳遞。接著作者探索了BDNF-TrkB信號在膠質(zhì)瘤中的促生長作用是否涉及突觸生物學調(diào)節(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物阻斷AMPARs或通過敲除NTRK2基因阻斷TrkB可降低體內(nèi)或神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)中腫瘤細胞的增殖（圖1j-m）。然而，沒有發(fā)現(xiàn)阻斷AMPARs和TrkB的疊加效應，這表明兩者之間存在機制相關(guān)性。

圖1. 神經(jīng)活動調(diào)節(jié)的BDNF促進膠質(zhì)瘤進展

（圖片源自《Nature》）

研究者在急性切片制備中對移植到海馬的膠質(zhì)瘤細胞進行了全細胞膜片鉗電生理實驗（圖2a）。發(fā)現(xiàn)在切片上灌注BDNF增加了谷氨酸誘發(fā)電流的振幅（圖2b，c）。證實膠質(zhì)瘤細胞TrkB激活介導谷氨酸誘發(fā)電流振幅的變化。與NTRK2野生型膠質(zhì)瘤異種移植細胞相比，NTRK2敲除阻止了BDNF誘導的谷氨酸誘發(fā)內(nèi)向電流振幅的增加（圖2b，c），與BDNF通過CAMKII鈣信號通路調(diào)節(jié)突觸強度的假設(shè)一致，CAMKII抑制劑KN-93阻斷了BDNF對膠質(zhì)瘤谷氨酸能電流振幅的影響，而非活性類似物KN-92則沒有（圖2d，e）。這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞中谷氨酸誘發(fā)電流的強度。

膠質(zhì)瘤中的谷氨酸能信號傳導可以是突觸性的，也可以是非突觸性的。為了測試BDNF對神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸電流的影響，研究者將軸突傳入神經(jīng)（Schaffer側(cè)枝）刺激到植入膠質(zhì)瘤細胞的海馬CA1區(qū)（圖2f）。暴露于BDNF后，膠質(zhì)瘤EPSCs的振幅增加（圖2g，h）。這些數(shù)據(jù)表明，BDNF增加谷氨酸誘發(fā)電流的強度。為了探索BDNF誘導的電流放大對細胞內(nèi)的影響，研究者對表達基因編碼鈣指示劑GCaMP6s的異種移植膠質(zhì)瘤細胞進行了原位鈣成像（圖2i）。如預期所示，局部應用谷氨酸可誘導膠質(zhì)瘤細胞中的鈣瞬變（圖2j-l）。在兩種不同的兒童膠質(zhì)瘤患者模型中，BDNF暴露增加了谷氨酸誘發(fā)鈣瞬變的強度和持續(xù)時間（圖2i-l）。

圖2. BDNF-TrkB信號傳導增加了膠質(zhì)瘤細胞中谷氨酸能電流的振幅

（圖片源自《Nature》）

在健康神經(jīng)元中，BDNF-TrkB信號通過CAMKII鈣信號通路增加AMPARs到突觸后膜的運輸（圖3a）。鑒于上述發(fā)現(xiàn)表明，BDNF增加了膠質(zhì)瘤中AMPAR介導的電流和鈣瞬態(tài)，研究者下一步研究了BDNF對膠質(zhì)瘤細胞中AMPAR轉(zhuǎn)運到細胞膜的影響。膠質(zhì)瘤細胞表達AMPAR亞基GluA2、GluA3和GluA4，暴露于BDNF后，細胞膜上這些亞基的水平都增加了。為了研究BDNF對GluA4和GluA3亞基的影響，使用抗體捕獲膠質(zhì)瘤細胞表面蛋白，并探索AMPAR亞基的水平。與BDNF增加AMPAR向膠質(zhì)瘤細胞膜運輸?shù)募僭O(shè)一致，與載體處理的對照膠質(zhì)瘤細胞相比，BDNF暴露增加了膠質(zhì)瘤細胞表面AMPAR亞基GluA3和GluA4的水平（圖3b-e）。

研究者們還生成了一個氟標記的鈣透性異構(gòu)體（GluA2（Q）） 以檢測GluA2亞基的運輸情況。他們在膠質(zhì)瘤細胞中表達了RFP標記的PSD95，以確認GluA2在膠質(zhì)瘤突觸后位點的定位。當亞基的N端從酸性pH值中移動時，熒光蛋白（SEPs）就會發(fā)出熒光將囊泡運輸?shù)郊毎ね獾闹行詐H值（圖3h）。而后他們將表達GluA2（Q）-SEP和PSD95-RFP的膠質(zhì)瘤細胞暴露于酸性培養(yǎng)基（pH5.5）中發(fā)現(xiàn)會淬滅信號，這表明突觸后點位的AMPAR熒光信號大部分來自質(zhì)膜結(jié)合的GluA2（圖3i，j）。單個光斑的時間過程成像表明，BDNF暴露引起膠質(zhì)瘤細胞突觸后GluA2水平的增加（圖3k-m），其時間尺度與GluA3和GluA4運輸?shù)脑黾樱▓D3b-e）和谷氨酸誘發(fā)電流的變化一致。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，BDNF-trkb信號傳導增加了AMPAR亞基到細胞膜的運輸，導致了上述谷氨酸誘發(fā)電流的增加。

圖3. BDNF調(diào)節(jié)AMPAR到膠質(zhì)瘤突觸后膜的運輸

（圖片源自《Nature》）

與前人研究結(jié)果一致的是，研究者使用膜片鉗電生理學觀察到異種移植的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的一個子集表現(xiàn)出向內(nèi)電流以響應谷氨酸，而NTRK2-KO腫瘤顯示對谷氨酸有反應的細胞較少（圖4a，b）。研究者先假設(shè)膠質(zhì)瘤細胞中NTRK2的缺失可能會改變惡性突觸連通性的程度。為了研究BDNF-TrkB信號是否調(diào)節(jié)神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤突觸連接的數(shù)量，他們對攜帶表達GFP的野生型和NTRK2-KO患者來源的膠質(zhì)瘤異種移植小鼠的大腦進行了免疫電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NTRK2-KO腫瘤中神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤的突觸結(jié)構(gòu)比野生型腫瘤少（圖4c，d）。與神經(jīng)元的共培養(yǎng)結(jié)果顯示，同NTRK2野生型膠質(zhì)瘤細胞相比，NTRK2-KO膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)的突觸結(jié)構(gòu)較少，神經(jīng)元的突觸前點與膠質(zhì)瘤突觸后點（PSD95-RFP）共定位（圖4e，f）。在神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)物中添加TrkB抑制劑也可以觀察到神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤突觸結(jié)構(gòu)的減少（圖4g）。這些數(shù)據(jù)表明BDNF-TrkB信號調(diào)節(jié)神經(jīng)元到膠質(zhì)瘤的突觸連接。

接下來，為了解釋突觸可塑性在膠質(zhì)瘤生長中的作用，他們又測試了去極化電流的大小是否會差異促進癌細胞增殖。使用光遺傳學策略來模擬不同程度的膠質(zhì)瘤突觸強度，通過對表達藍光敏感陽離子通道ChR2的患者源性膠質(zhì)瘤細胞施加不同的藍光脈沖持續(xù)時間（光脈沖寬度）來控制膠質(zhì)瘤膜-膜去極化的幅度。結(jié)果表明，施加5ms或25ms的光脈沖寬度刺激會導致膠質(zhì)瘤細胞膜的去極化幅度隨著光脈沖的持續(xù)時間而增加（圖4h，i）。表達ChR2的異種膠質(zhì)瘤移植物體內(nèi)的去極化顯示，隨著膠質(zhì)瘤膜去極化程度的增加，膠質(zhì)瘤增殖率增加（圖4j，k）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)將惡性突觸可塑性與膠質(zhì)瘤病理生理聯(lián)系起來。

總之，這些發(fā)現(xiàn)表明BDNF-TrkB信號傳導能促進惡性突觸可塑性增強從而推動腫瘤進一步發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)是癌癥神經(jīng)學的重大突破，為腦膠質(zhì)瘤治療藥物的開發(fā)以及突觸功能障礙相關(guān)疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。

圖4. 神經(jīng)元-膠質(zhì)瘤連接的可塑性及突觸強度增加對腫瘤性能的影響

（圖片源自《Nature》）

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